铁皮石斛组织培养一次成苗技术

铁皮石斛种苗组织培养技术快速繁殖已初具规模，但一次成苗技术鲜有报道。组织培养一次成苗技术即是用一种培养基完成种苗的整个生长过程，极大简化了组织培养流程。在铁皮石斛组织培养研究中多以种子为外植体[3]，但是鲜有以茎段为外植体的一次成苗技术的报道，且可适于外植体培养的种子很少，很难满足市场需求。本研究旨在简化育苗流程，降低成本，促进铁皮石斛的产业化发展。

1 材料和方法

1.1 材料

试验所用的铁皮石斛材料于2017 年5 月选自于江苏省林科院。挑选健康、无病虫害植株，以茎段作为外植体。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的处理。选取长势良好、均匀、叶片繁茂的铁皮石斛材料，将其茎段从植株上剪下，去掉叶片后，剪取一定长度的带节间茎段，将其放入搪瓷缸中，再将纱布盖在搪瓷缸口，用流水冲洗20min。之后再将洗衣粉倒在搪瓷缸里，用玻璃棒搅拌均匀，浸泡30min。用流水冲洗干净后，将材料用75%的酒精浸泡30s，无菌水冲洗1 次，再用0.1%的升汞浸泡8min，用无菌水冲洗5~8 次，材料灭菌后应立即取出，然后放在无菌纸上沥干，留待接种。

1.2.2 一次成苗初代培养基的筛选。基本培养基使用MS 和1/2MS，分别添加0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L 的NAA 与1mg/L、3mg/L、5mg/L 的6- BA，在此基础上添加香蕉泥100g/L、蔗糖30g/L、琼脂6.5g/L，pH 值为5.8。将消毒好的铁皮石斛茎段接种在上述不同处理的培养基中，每种处理接种外植体10 瓶，每瓶接种5 个茎段材料。将所有的组培苗放在光照强度为2000Lx，温度为（25±2）℃的培养室里，35d 后统计不定芽的诱导率。不定芽的诱导率（%）= 诱导出芽苗数/ 未污染的接种数，统计并作好记录，从而筛选出一次成苗的最适培养基。

表1 不同的培养基对成苗的影响

2 结果

试验结果表明，基本培养基为1/2MS 的铁皮石斛组培苗不定芽的诱导率普遍比基本培养基为MS 的不定芽诱导率高，且长势普遍良好，比基本培养基为MS的组培苗效果更加明显，诱导的不定芽更多，更加壮实。在接种茎段后的5~15d 内，不同处理的铁皮石斛组培苗都开始发芽，但是随着时间的推移，在生长后期开始出现明显差距，有的不定芽生长不明显，有的不定芽生长慢，非常细弱。基本培养基为1/2MS 的铁皮石斛组培苗明显长势普遍更佳，组培苗的不定芽数更多，不定芽长得更加健壮。

培养基中不同浓度的激素含量对组培苗的不定芽的生长诱导及促进有一定程度的差异。在植物组织培养中最常用的是生长素和细胞分裂素，本实验选用了其中最具代表性的NAA和6- BA 来进行研究。

当培养基中的激素NAA 浓度在0.5mg/L 时，铁皮石斛组培苗不定芽生长的数量及其诱导率相比，NAA浓度为0.3mg/L 以及0.7mg/L 时更多更高，而且较其而言，当培养基中的NAA 为0.5mg/L 时其组培苗长势更佳，不定芽长得更加壮实、健康、旺盛。但当NAA 在0.3mg/L 以及0.7mg/L 时，不定芽的诱导率相比较而言较低，对组培苗不定芽的生长，不定芽的诱导有一定程度的抑制作用；当培养基中的6- BA 为3mg/L 时，铁皮石斛组培苗的不定芽的诱导率比较高，不定芽生长的数量及其诱导率相比6- BA 浓度为1mg/L 以及5mg/L时更多更高，且培养基中的6- BA 为3mg/L 的石斛组培苗长势相较更佳，当培养基中的6- BA 浓度为1mg/L及5mg/L 时，对铁皮石斛组培苗的不定芽的诱导与生长起到一定程度的抑制作用，长势也相较略差，不定芽长得比较缓慢，瘦弱。数据表明：随着培养基中的激素NAA浓度的提高，激素6- BA 对不定芽诱导与生长的影响呈现着先增大后减小的趋势，这说明过高或过低浓度的6- BA 对不定芽的增殖有着一定程度的抑制作用。从整体来看，培养基中的激素NAA 对铁皮石斛组培苗不定芽诱导与生长的影响随着其浓度的增高而逐渐开始抑制。由此可见：选取合适的培养基激素浓度对组培苗不定芽的增殖有显著的促进作用。

总的数据统计表明：培养基中的NAA 浓度在0.5mg/L 以及其中的激素6- BA 浓度为3mg/L 时，铁皮石斛的组培苗不定芽的诱导与生长情况为最佳状态，这2种浓度的激素都极利于不定芽的生长。在培养基中加入的激素NAA 浓度为0.3mg/L、0.7mg/L 以及培养基中的激素6- BA 浓度为1mg/L、5mg/L 时，组培苗的不定芽诱导率都相较较低而且不定芽的数量也很少，生长明显缓慢，生长后期几乎停止生长，且不定芽长得十分瘦弱，长势不佳。因此，由此可得出铁皮石斛一次成苗的最适培养基配方为：1/2MS+ 蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L+ 香蕉泥100g/L+NAA 0.5mg/L+ 6- BA3mg/L，pH 值为5.8，这一培养基最利于铁皮石斛组培苗不定芽的诱导与生长。

3 讨论

石斛一直被认为是中药中的上品，已在临床上及中药复方中被广泛应用。况且，铁皮石斛的花朵外形优美，花香怡人，广受人们的喜爱并具有极高的观赏价值，在国际花卉市场上占有重要的地位。但是由于人们对铁皮石斛的过度开采，它的的野生生态坏境遭到严重破坏，野生资源正在大幅度减少，已濒临绝迹，但是与此同时，它的市场的需求量在逐年上升，铁皮石斛材料短缺，作为濒临灭绝的受保护中药品种之一[4]，市场售价较高。铁皮石斛人工培养具有重大意义，现关于铁皮石斛快繁体系研究颇多并有显著成果，在市场上多已利用于规模生产，但在其组织培养繁殖[5]方面仍存在问题，并且关于以其茎段为外植体的一次成苗技术鲜有报道，其系统性也不够，本研究主要在前人研究的基础上，课题组成员多方查阅文献资料，广泛进行调查研究，对国内外本项目领域的研究现状进行分析，对铁皮石斛一次成苗过程进行初步研究，以期能够简化铁皮石斛组培种苗培育的流程，将其投入大规模的工厂生产可大大降低成本，缩短种苗的繁育时间，以期推动铁皮石斛的产业化进程